优化原位杂交(ISH)的10个小技巧

10 Tips for Optimizing In Situ Hybridization (ISH)

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  Enzo Life Sciences在研究试剂盒,生物化学品和生物制品的制造和供应方面拥有40多年的经验。作为为科学家提供支援的科学家,我们很乐意提供简单但有用的技巧,以改善您日常任务以及研究的整体质量。从这一点出发,以下我们为您提供了在原位杂交中获得高质量数据的综合技巧。原位杂交是一种广泛使用的生物技术,它能为准确定位分裂中期滴片、细胞和组织中内源性的、细菌或病毒的核酸(如DNA,mRNA和microRNA)。

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1.合适的探针


  由于杂交可以发生在互补的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之间,故DNA或RNA探针(又称为核糖探针)都可以用于定位给定样品中的DNA或RNA。然而,RNA-RNA杂交体比RNA-DNA杂交体更稳定,而RNA-DNA杂和体又比DNA-DNA杂合体更稳定。双链DNA探针易于在实验室中进行制备、标记和使用;而单链RNA探针的大小均一,可实现标记的高度插入,并形成高度稳定的RNA-RNA杂交体。而且,单链寡核苷酸探针(Oligonucleotides)如今可以通过化学方法简单地合成并且加上高比放射性。目前,也可以使用肽骨架或锁核酸(LNA)作为替代品,以提高杂交效率和稳定性。

 


2.合适的标签


  用于组织微阵列的放射性标记探针应使用35S-NTP,以避免信号溢出。如果实验目的是使与周围细胞或组织结合的探针可视化(最常见的情况),那么您可以选择能够使探针能被直接检测的一系列荧光染料。又或者,您可以使用如生物素、地高辛或者色原体等间接标记,这类标记不易随着时间变化而发生信号猝灭,与免疫组织化学(IHC)类似。

 


3.正确的标记技术


  缺口平移法或随机引物标记法是产生长的双链DNA探针的方法(推荐使用ENZ-GEN111-0050),而使用含RNA聚合酶启动子的载体则可用于体外转录以制备RNA探针。寡核苷酸可以在其合成期间直接标记,或者可以使用末端脱氧核苷酸转移酶或T4多聚核苷酸激酶将标记的核苷酸添加至其末端。

 


4.合适的检测方法


  由于荧光标记可以在FISH探针合成期间引入并通过荧光显微镜检测,因此可以进行直接检测。这样,可以容易地进行多重检测,因为可以在任何时间观察两种或更多种不同荧光团标记的不同探针(推荐ENZO SEEBRIGHTTM系列)。生物素标记可以用来自蛋清的亲和素或来自细菌S. avidinii的链霉亲和素检测,而地高辛可以与地高辛抗体配对。两种间接标记方法最终可以用碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)来处理,与特定底物反应产生CISH的显色沉淀,从而达到可视化的目的。

 


5.优化蛋白酶K的消化


  蛋白酶K的消化是ISH成功的关键步骤,因为消化不足将导致杂交信号减弱。另一方面,如果样品过度消化,组织的形态将会很差或完全被破坏,导致无法定位杂交信号。因此,蛋白酶K的最佳浓度会根据组织类型、固定长度和组织大小而变化。 通常,在室温下使用1-5 μg/ mL蛋白酶K处理 10min是开展ISH的一个不错的起始点。蛋白酶K消化最佳条件的确定应以系列不同浓度的蛋白酶K进行滴定,然后再与所选择的探针杂交。产生最高杂交信号且蛋白质组织或细胞形态被破坏最少时的蛋白酶K浓度即为您应该选择的浓度。

 


6.强化杂交条件


  强化杂交条件的目的是仅在探针和其靶标之间获得杂交,从而实现可能的最高特异性。杂交特异性(严格度)主要由探针和靶核酸序列之间的同源性程度、探针浓度、温度和杂交时间,以及杂交溶液中存在的单价阳离子的浓度所决定。尤其应该仔细地优化杂交温度,通常在55和62°C之间,以获得高度特异性的结果。甲酰胺允许杂交在显著低于探针-靶-杂交体的实际解链温度的温度下进行,从而有助于保护样品的形态。为了更好地标记目的基因,通常会引入COT序列(ENZ-GEN116-0500)以减少与重复DNA序列的非特异性杂交。

 


7.优化杂交后处理条件


  反应之后,接下来进行的是增加严格度的杂交后洗涤,以出去不完全的配对,使靶序列上仅留下特异性结合的探针。如果您在ISH分析中遇到高背景,您可以用核酸酶消化非特异性结合的探针来进一步降低背景。例如,在进行检测步骤之前,使用S1核酸酶处理DNA探针,使用RNase来处理RNA探针。

 


8.如果使用DNA探针,修改洗涤步骤


  DNA探针有着与RNA探针相同的灵敏度,但DNA探针不能像RNA探针那样与样品中的靶分子结合得那么牢固。 因此,当使用DNA探针时,不应在杂交后使用甲醛洗涤。

 


9.优化检测


  使用生物素标记的探针时,请注意生物素也是在细胞和组织中产生的内源性物质。因此,内源性的生物素可能导致非特异性染色,因为基于(链霉)亲和素的检测系统将与样品中所有可接触的生物素分子结合。在这些情况下,您需要通过在探针杂交之前向样品中添加过量(链霉)亲和素来阻断内源性生物素,或者您应该使用地高辛代替生物素来作为探针标记。地高辛是从洋地黄植物中分离的非放射性免疫标签,因此不太可能被除抗地高辛抗体之外的生物材料检测到。因此,地高辛标记的使探针检测有着高亲和力、高灵敏度以及最重要的特异性。

 


10.经常更换试剂


  为了获得最具可重复性和有效的数据,应每2-3周补充一次三乙醇胺和乙酸酐,每3-4天更换10%中性甲醛溶液(NBF)。


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