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UltraRIPA 脂筏提取缓冲液套装
UltraRIPA kit for Lipid Raft

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大幅度提升膜蛋白提取效率的新一代 RIPA 缓冲液



  与常规的非变性细胞裂解缓冲液(RIPA buffer, 1% Triton X-100 等)相比,这款缓冲液套装(Buffer Kit)能迅速且高效地提取增溶相对困难的脂筏(Lipid Raft)蛋白质。从常规缓冲液中不可溶而丢弃的膜组分中,在维持蛋白质功能的情况下能实现高效地提取,有利于对脂筏等蛋白质的功能分析。

  ※本产品仅限于研究用。不可用于临床治疗。

 


◆细胞膜上的不溶性成分——脂筏(Lipid Raft)


  裂解细胞进行蛋白质功能分析的时候,经常会使用 RIPA (Radio-Immuno Precipitation Assay)缓冲液和1% Triton X-100 缓冲液等的相对温和的细胞膜裂解缓冲液。这些缓冲液对蛋白质的构造和功能的影响小,适用于酶活性试验、免疫沉降和各种结合实验等蛋白质的功能分析。另一方面,与具有很强的蛋白质变性作用的 SDS 缓冲液相比,增溶能力较弱,完全不能溶解以脂筏(Lipid Raft)为主的细胞膜组分。许多表面活性剂都不能溶解脂筏,故其又被称为 Detergent Resistant Membrane(DRM)。DRM中所含蛋白质的功能分析被认为是十分困难的。

 

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  脂筏(Lipid Raft)是由胆固醇(cholesterol)和鞘磷脂(sphingomyelin),GPI锚定蛋白(GPI anchor protein)和棕榈酰化(palmitoylation)蛋白质组成的细胞膜构造,被认为是整合各种功能蛋白的功能域。神经细胞突触和免疫细胞的免疫突触是脂筏的代表性例子。

 

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脂筏示意图



◆特点


操作简单,能快速提取脂筏蛋白

使用两种类型的缓冲液(A buffer,B buffer)进行两个阶段的提取。先提取出胞浆蛋白和非脂筏蛋白,然后提取脂筏蛋白

Buffer 提取的任何蛋白质都不会失活

A buffer 和一般的 RIPA buffer 成分相同*。B buffer 含有表面活性剂,可以通过透析除去

适用于哺乳动物细胞/组织

使用本品配制的溶解液适用于酶活性试验、免疫沉淀(Immunoprecipitation)、蛋白定量(BCA 法)、SDS-PAGE 和 Western blot 等

1% NP-40 Alternative,0.1% SDS,50 mMTris-HCl (pH8.0),150 mMNaCl,0.5% Sodium Deoxycholate


 

◆缓冲液套装组成


  ● A buffer (RIPA buffer) (100 mL)

  ● B buffer(10 mL)

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◆使用方法


1、用 A buffer 溶解组织或培养细胞。
为了提高溶解效率,推荐使用均质或超声波破碎设备。
2、

进行离心分离,使 A buffe r中可溶性组分(上层清液)和不溶性组分(沉淀)分离,分别回收。上层清液 A buffer 可溶性组分中主要含有胞浆蛋白和非脂筏蛋白。

3、往沉淀的 A buffer 不溶性组分中加入 B buffer,形成悬浊液。
4、进行离心分离,与步骤2一样分离出可溶性组分(上层清液)和不溶性组分(沉淀),分别回收。上层清液的 B buffer 可溶性组分中含有脂筏蛋白。
5、可应用于各种实验。
A buffer 和 B buffer 不可用于 Bradford 法蛋白质定量。蛋白质定量请使用 BCA 检测。
使用本品 A buffer 和 B buffer 进行两个阶段的提取是最适宜的,也有只对细胞使用 B buffer 进行溶解和提取的例子。具体请参照以下例子。


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UltraRIPA kit 、1% SDS buffer和RIPA buffer的比较



蛋白分离

蛋白结构

蛋白功能

应用

胞质蛋白

膜蛋白

非脂筏蛋白

脂筏蛋白

>1%SDS buffer

SDS-PAGE

RIPA   buffer

酶分析法测定

免疫沉淀

SDS-PAGE等

UltraRIPA



◆应用例


从脂筏中提取总蛋白


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  用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后,回收 A buffer 不溶性组分(RIPA-insoluble fraction),添加2% SDS,RIPA buffer 和 UltraRIPA kit B buffer 进行提取。提取后的总蛋白用 SDS-PAGE/银染色检测(左),用 BCA 法定量蛋白质(右)。相对于具有很强的蛋白质变性作用的2% SDS 缓冲液,UltraRIPA kit 能够提取 70% 以上的蛋白质。

  ※不能保证全部蛋白质的可溶性都得到改善。



脂筏标记蛋白的提取


  用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后,回收 A buffer 不溶性组分(RIPA-insoluble fraction),添加2% SDS,RIPA buffer 和 UltraRIPA kit B buffer,提取后进行 SDS-PAGE。利用对应脂筏标记蛋白的抗体进行 Western blot 检测。


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脂筏标记蛋白的免疫沉淀


  用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后,回收 A buffer 不溶性组分,通过 B buffer 提取脂筏标记蛋白。对 buffer 提取物使用脂筏标记蛋白 PSD95 的抗体和G蛋白偶联磁珠进行免疫沉淀。使用银染色和抗 PSD95 抗体通过 Western blot 检测进行确认。


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提取的蛋白质的酶活性测定


  用1%TritonX100,RIPA buffer,UltraRIPA kit B buffer 和2%SDS 溶解 CHO 细胞,测定溶解物中乳酸脱氢酶(LDH)的活性。2%SDS 具有很强的蛋白质变性作用,在几乎完全失活的情况下,1% Triton X100,UltraRIPA kit A buffer,和 UltraRIPA kit B buffer 所得的酶活性大致相同。


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从脂筏中提取功能蛋白


  用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后,回收 A buffer 不溶性组分。用 A buffer 分三次冲洗不溶性组分,消除 RIPA 可溶性组分中脱磷酸酶的活性。往不溶性组分中分别添加2% SDS buffer,A buffer(RIPA buffer)和 B buffer,测定各种提取物的总脱磷酸化酶活性。下图是各缓冲液从 RIPA 不溶性组分中提取的蛋白质的量(左轴:黑)和所检测的脱磷酸酶的活性(右轴:红)的示意图。2% SDS buffer 能够从 RIPA 不溶性组分中很好地提取蛋白质,但容易导致蛋白质变性,完全失去脱磷酸化活性。RIPA buffer 不能提取蛋白质,活性也无法检测。UltraRIPA kit B buffer 所提取的蛋白质大约为2% SDS buffer 的 70%,且可以检测出较强的脱磷酸化活性。

 

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UltraRIPA kit B buffer 单独提取脂筏蛋白的可能性评价

※数据提供:东京大学药学院研究生院保健化学系


  用 PBS 冲洗 COS-1 细胞,分别使用 SDS buffer,1% Triton X-100 buffer,UltraRIPA kit A buffer 和 UltraRIPA kit B buffer裂解,通过离心分离(14,000 rpm,5 min,4℃)可溶性组分和不可溶性组分。不可溶性组分用等量的 SDS-PAGE 样品缓冲液变性溶解。脂筏标记 Flotilin1 的可溶部分通过 SDS-PAGE/western blot 测定。使用1% Triton X-100 和 RIPA buffer,大部分的 Flotilin 1 不溶性膜组分没有被溶解,而 UltraRIPA kit B buffer 几乎可以全部溶解。


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◆各buffer组成


SDS buffer(2%SDS, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mM NaCl)

UltraRIPA kit A buffer (1% NP-40 Alternative,0.1% SDS,50 mM Tris-HCl (pH 8.0),150 mM NaCl,

0.5% Sodium Deoxycholate)

UltraRIPA kit B buffer (成分保密)
1% Triton X-100 (1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150mM NaCl)



欲了解更多相关产品信息,请点击文字:ULTRARIPA® Kit 应用数据

欲了解更多产品信息,可点击文字下载PDF:ULTRARIPA® Kit for Lipid Raft


Q-1.

如果单独使用B缓冲液,溶解效率是否高于 RIPA 缓冲液?

A-1.

B缓冲液的溶解活性比 RIPA(A缓冲液)高。本试剂盒的操作分为2个阶段,首先将 RIPA 不溶性组分回收并用B缓冲液将其溶解,并以浓缩和简单提取 RIPA 不溶性组分中含有的脂筏蛋白为目的而进行第2阶段的操作。但是,如果是直接用B缓冲液处理样本的时候,溶解率的确比 RIPA 高。


Q-2.

使用 ULTRARIPA® Kit 是否只可以提取脂筏蛋白?

A-2.

多数研究认为,脂筏的细胞膜穴样内陷和神经突触中含有的组成蛋白不能用 Triton X-100 等温和的表面活性剂溶解,因此认为表面活性剂的不溶性组分(DRM)是生化脂质筏。本产品着眼于 RIPA 不溶性组分富含的脂筏蛋白,用B缓冲液进一步使其溶解,使得脂筏蛋白在非变性状态下溶解。因此,即使不是脂筏,只要是不溶于 RIPA 的样本,都可以使用本试剂盒进行检测(关于核蛋白的污染参见 Q-3)。本试剂盒使用溶解能力较高的 RIPA 缓冲液作为A缓冲液,但是也可以用1% Triton X-100 等的裂解缓冲液代替 RIPA 缓冲液。


Q-3.

推荐使用均质或超声破碎设备,单独使用涡旋和移液是否不够充分?

A-3.

本产品采用A缓冲液溶解后离心,并回收 RIPA 不溶性组分这样简单的步骤。因此,如果有细胞/组织的未破碎物或核残留的话,则可能污染 RIPA 不溶性组分。特别是 RIPA 缓冲液的核溶解效率较弱,如果不添加物理破碎,则核可能会大量残留在 RIPA 不溶性组分中。另一方面,由于B缓冲液的核溶解率较高,如果有核残留的话就会释放出 DNA,使溶液变浑浊。在A缓冲液溶解时进行超声处理的话可以破坏核以及使基因组 DNA 片段化。核的污染可能会影响后续的应用,因此,我们强烈推荐使用均质或超声破碎设备。


Q-4.

B缓冲液的成分是什么种类的表面活性剂。听说表面活性剂的种类会影响电泳,我想知道它的成分。

A-4.

非常抱歉,B缓冲液的成分是非公开的。 我们无法告诉您表面活性剂的种类。然而,我们可以确定B缓冲液不会影响电泳。


Q-5.

几乎无法看见A不溶性组分。即使添加了B缓冲液也无法获取蛋白质量,怎么办?

A-5.

RIPA 缓冲液可以溶解90~95%包括膜蛋白在内的总蛋白(根据组织/细胞种的不同多少会有点差别)。因此,考虑蛋白质总量时,RIPA 不溶性组分中含有的蛋白为样本总体的10%以下。肉眼无法看见 RIPA 不溶性组分时,需要增加细胞数/组织量。想要提高B缓冲液溶解组分蛋白浓度时,减少添加至 RIPA 不溶性组分的B缓冲液的量就可以得到改善。我们建议您可以设置如下的阳性对照。


探讨样本量的阳性对照实验

需要准备的试剂:2% SDS缓冲液(50 mM Tris-HCl(pH 8.0),150 mM NaCl,2% SDS)

步骤:回收 RIPA 不溶性组分后,添加2%SDS缓冲液,通过进行蛋白质定量检测,可以预估 RIPA 不溶性组分中含有的蛋白质总量。


Q-6.

在A缓冲液溶解组分中可以观察到脂筏标记物,有什么改善的方法吗。

A-6.

我们无法保证在其他方法中作为脂筏标记物被检测出的蛋白能否在A缓冲液不溶性组分中获得。特别是根据脂筏标记物的不同,细胞种类/组织,有无外部信号也会有变动。我们会根据以下案例提供相关的改善方法,请酌情参考。


例1:不溶于1%Triton X-100,但用RIPA缓冲液可以检测出可溶性组分。

改善方法:可能是由于RIPA缓冲液(1%NP-40,0.1% SDS,0.5% sodium deoxycholate)的提取效率比1%Triton X-100强,所以能将其溶解。这时候,可以通过用1%Triton X-100缓冲液代替A缓冲液来浓缩以及溶解目的蛋白。

例2:离心条件不足时,虽然不溶解,但是不沉淀。

改善方法:虽然我们推荐的离心条件为10,000×g,但是根据目的蛋白的不同,离心10,000×g可能不足。这时,也有把离心条件调整为20,000×g之后得到改善的案例。因此,我们建议您可以探讨一下离心条件。


Q-7.

用B缓冲液洗脱的蛋白可以用于质谱分析吗?

A-7.

B缓冲液溶解的蛋白经过SDS-PAGE分离后,可以通过一般的蛋白质组学分析的顺序(切割凝胶,在凝胶中进行胰蛋白酶消化,提取肽以及脱盐操作)进行分析。


Q-8:

用B缓冲液提取后,我想用适合试验的缓冲液来置换它。 可以通过透析去除B缓冲液的表面活性剂吗?

A-8:

B缓冲液含有的表面活性剂可以通过透析去除。请使用孔径为5 kDa的透析膜。但是,也有根据蛋白质的不同,在去除表面活性剂时也可能会聚集或变性,需要添加别的表面活性剂到透析缓冲液中。建议进行预实验。



产品列表
产品编号 产品名称 产品规格 产品等级 备注
F015 UltraRIPA kit for Lipid Raft 1kit

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