蛋白磷酸化研究的预制胶
SuperSep Phos-tag™
SuperSep Phos-tag™ 是研究蛋白磷酸化的方法，无需特异性磷酸化抗体或者同位素标记。
◆SuperSep Phos-tag™
Phos-tag™ 是一种预制胶，预先加入了 50 μmol/L 的 Phostag™ Acrylamide，打开包装即可直接使用。预制胶中含有锌作为金属离子，在中心凝胶缓冲液中保存稳定性很好，得到的带条结果也很整齐。
磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作为不同条带分离。
分离后，胶可用于考马斯亮蓝染色，免疫印迹和质谱实验。
◆Phos-tag™ SDS-PAGE 的原理
◆在 HighWire Search 上搜索到的论文数
◆运用
利用 p35 的丙氨酸突变体确定 Cdk5 激活 p35 的磷酸化位点
p35 常见的磷酸化位点是 Ser8 和 Thr138。但是 Ser8 和 Thr138 位点往往会发生丙氨酸突变，产生３种突变体（Ser8 突变体：S8A，Thr138 突变体：T138A，Ser8 和 Thr138 双突变体：2A）。这３种突变体、野生型 p35、Cdk5 和没有激酶活性的 Cdk5 都来源于 COS-7 细胞。这些细胞裂解液用Phos-tag™ SDS-PAGE 和 Western blotting 进行检测（检测抗体：p35 抗体）。
100 μM Phos-tag ™ 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝胶
可明确磷酸化位点和条带迁移率的关系！
- 泳道１（条带 L2 和 L4）和泳道５（条带 M1）：p35 在 Cdk5 的作用下发生了磷酸化；
- 泳道１（条带 L2 和 L4）和泳道３（条带 L2 和 L4）：在无激酶活性 Cdk5 的作用下，大约有一半 p35 蛋白在 Thr138 位点发生磷酸化，同样在 138 位发生突变的 p35 蛋白亦是如此。
- 泳道５ （条带 M1）和泳道６（条带 L3 和 L4）：Ser8 和 Thr138 是主要的磷酸化位点；
- 泳道５（条带 M1）、泳道７（条带L1和L2）和泳道８（条带M2）：条带 M1 是 Ser8 和T hr138 都发生磷酸化的条带；
条带 M2 是只有 Ser8 磷酸化的条带；条带 L1 和 L2 是只有 Thr138 磷酸化的条带。
※ 条带 L1 和 L3 中的Ｘ是不确定哪个位点发生磷酸化的条带；
※ 条带L4是非磷酸化的 p35 。
【参考文献】
▪ Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ™ SDS-PAGE. T. Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 - 1143.
【结果提供】
理化学研究所 脑科学综合研究中心 回路功能研究核心 记忆功能研究团队 细川智永（Dr. T. Hosokawa）
首都大学东京 理工学研究科 生命科学专业 神经分子功能研究室 久永真市（Dr. S. Hisanaga）
检测含有 Dnmt1 磷酸化激酶的片段
我们可以确定在片段中含有目的激酶！
① 采用亲和色谱法从鼠脑提取液中纯化 GST-Dnmt1（1-290）结合蛋白
② 使用 0.3 M 和 1 M NaCl 的 DNA 纤维素柱洗脱得到目的蛋白
③ GST-Dnmt1（1-290）作为体外激酶实验的反应底物
④ Phos-tag ™ SDS-PAGE 用于Western blotting，确定迁移条带中每个片段的激酶活性
【参考文献】
The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase 1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and I. Kameshita, Biochem. J., May 2010; 427(3): 489-97.
【结果提供】
高知大学 综合研究中心 生命、功能物质部门 实验实习机器设施 杉山康宪（Dr. Y. Sugiyama）
香川大学 农学部 应用生物科学科 动物功能生化学研究室 龟下勇（Dr. I. Kameshita）
二维电泳中的应用：分析 hnRNP K 磷酸化异构体
小鼠巨噬细胞 J774.1 经 LPS 刺激后，裂解细胞，经过免疫沉淀法分离得到 hnRNP K。在二维电泳中，一维是 IPG 胶，二维是 Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分离 hnRNP K 的异构体。利用质谱仪，可以确认不同的点代表不同的亚型或修饰蛋白。
同一个等电点的位置上，不同位点发生磷酸化都可以被区分开来
（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）
【参考文献】
▪ Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95.
【结果提供】
横滨市立大学 生命纳米系统科学研究科 生物体超分子系统科学专业 木村弥生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）
理化学研究所 RCAI 小原收
◆备注
样品制备：
Phos-tag SDS-PAGE 对于蛋白样品中的杂质非常敏感，尤其是螯合剂，钒酸，无机盐，表面活性剂这类物质。
强烈建议在 Phos-tag SDS-PAGE 之前通过 TCA 沉淀或渗析法降低杂质含量。
转膜前处理：
另一个必须的步骤是在转膜前，用 EDTA 去除凝胶中的金属离子（Mn2+ 或者Zn2+）；该步骤可提高蛋白的转膜效率。
● 分别准备 10 mmol/L 含 EDTA 和不含 EDTA 两种 1x transfer buffer。
● 将凝胶浸泡在含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer，至少 20 分钟，温和摇晃。更换新缓冲液，重复３次。
● 将凝胶浸泡在不含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer，10 分钟，温和摇晃。
● 转膜操作*。
* 建议用湿法转膜，以提高转膜效率。
◆质量控制
每一批 SuperSep Phos-tag™，出厂前均根据其产品规格进行测试，以保证可分离磷酸化和非磷酸化蛋白，以及他们的分离成都在正常参数内。
◆保存温度
2-10℃
◆产品信息
用于 Bio-Rad 伯乐电泳仪
货号 | 品名 | 电泳仪 | 规格 |
SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 7.5%, 17well, 83×100×3.9mm | Mini-PROTEAN® Tetra Cell (Bio-Rad Laboratories, Inc.) | 5 块 | |
SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 12.5%, 17well, 83×100×3.9mm | 5 块 |
用于 Life Technologies 电泳仪
货号 | 品名 | 电泳仪 | 规格 |
SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 7.5%, 17well, 100×100×6.6mm | XCell SureLock® Mini-Cell (Life Technologies, Inc.) | 5 块 | |
SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 12.5%, 17well, 100×100×6.6mm | 5 块 |
用于 Wako EasySeparator 电泳仪
| 产品编号 | 产品 | 凝胶浓度 | 孔数 | 包装 |
| 192-17401 | SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L) Phos-tag™ 预制胶50 μmol/L | 6.0% | 13孔 | 5块 |
| 199-17391 | 6.0% | 17孔 | 5块 | |
| 195-17371 | 7.5% | 13孔 | 5块 | |
| 192-17381 | 7.5% | 17孔 | 5块 | |
| 193-16711 | 10.0% | 13孔 | 5块 | |
| 190-16721 | 10.0% | 17孔 | 5块 | |
| 195-16391 | 12.5% | 13孔 | 5块 | |
| 193-16571 | 12.5% | 17孔 | 5块 | |
| 193-16691 | 15.0% | 13孔 | 5块 | |
| 196-16701 | 15.0% | 17孔 | 5块 | |
| 197-16851 | 17.5% | 13孔 | 5块 | |
| 194-16861 | 17.5% | 17孔 | 5块 |
◆相关产品
| 产品编号 | 产品名称 | 规格 |
| 292-36411 | EasySeparator Phos-tag预制凝胶的配套电泳槽 | 1 set |
Q1. | 我们可以采用哪种凝胶染色法？ |
A1. | 所有的染色法都可使用，最常用的例如考马斯亮蓝染色法，负染，银染和荧光染色等。 |
Q2. | 用考马斯亮蓝染法染色，着色不明显。 |
A2. | 在微波炉内进行脱色，会取得比较满意的效果。 方法：将染色的胶放在 100 毫升去离子水里，用擦拭纸包裹胶，再放进微波炉加热几分钟后更换去离子水，并重复上述步骤3或4次。请注意防止盛放胶的容器温度过高。 |
Q3. | 此款产品能否用于免疫印迹？ |
A3. | 可以，如果用 EDTA 清除胶里面含有的锌，可以提高转膜的效率。 方法：胶浸在含有 10 mmol/L EDTA 的转移缓冲液（25 mmol/L tris、192 mmol/L甘氨酸，10％甲醇）里轻轻搅拌 10 分钟。重复上述步骤３次。然后放进不含 EDTA 的转移缓冲液（25 mmol/L tris、192 mmol/L的甘氨酸，10％甲醇）里搅拌 10 分钟并转移到 PVDF 膜或 NC 膜（硝酸纤维素膜）上。 |
Q4. | 条带扭曲了。 |
A4. | 含有 EDTA，无机盐，表面活性剂等的样品可能会导致条带弯曲或者拖尾。通过 TCA 或透析沉淀脱盐样品。空白泳道也会导致相邻样品条带弯曲，在空白泳道加与样品相同体积的样品缓冲液(x1)。 |
Q5. | 磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白不能分离。 |
A5. | 将β-酪蛋白（038-23221）作为 Phos-tag SDS-PAGE 电泳的阳性对照，将用碱性磷酸酶处理的β-酪蛋白作为阴性对照，并检查条带的迁移。如果只有一个条带，可能是由于 Phos-tag™ 或丙烯酰胺的浓度没有优化导致磷酸化和非磷酸化蛋白不能分离。 |
Q6. | 可用在细胞的粗提物上吗？ |
A6. | 可以的，可能 Rf 值可能有稍低，由于目的蛋白的因素，条带可能会比较模糊。 |
Q7. | 上样量多少？ |
A7. | １至５微克纯化的蛋白（考马斯亮蓝染法），10 至 30 微克的组织或细胞提取物（取决于蛋白质的表达量）。 *这是推荐的用量，可以先进行常规的 SDS-PAGE 和免疫印迹法，确定合适的上样量。 |
Q8. | 使用哪种蛋白marker？ |
A8. | 不推荐使用蛋白 marker。该款产品不需要蛋白 marker。因此，建议用来源于大肠杆菌的重组蛋白或者是非磷酸化样品作为阴性对照代替蛋白 marker。 |
Q9. | 此款产品的配离子是什么？ |
A9. | 锌离子 |
Q10. | 我们怎么知道是因为蛋白发生磷酸化条带才会发生迁移？ |
A10. | 使用 12.5% SuperSep™ Ace（Wako 目录 No. 199-14971）进行电泳（有相同的胶浓度），检查目标蛋白质是否降解。 |
参考文献
| 1. | Apostolidis, S. A., Rauen, T., Hedrich, C. M., Tsokos, G. C., & Crispín, J. C. (2013). Protein phosphatase 2A enables expression of interleukin 17 (IL-17) through chromatin remodeling. Journal of Biological Chemistry, 288(37), 26775-26784. 全文 【IF=4.238】 |
| 2. | Baek, J. H., Gomez, I. G., Wada, Y., Roach, A., Mahad, D., & Duffield, J. S. (2018). Deletion of the Mitochondrial Complex-IV Cofactor Heme A: Farnesyltransferase Causes Focal Segmental Glomerulosclerosis and Interferon Response. The American journal of pathology, 188(12), 2745-2762. 全文 【IF：3.491，预制胶浓度7.5%】 |
| 3. | Bouvet, M., Dubois-Deruy, E., Alayi, T. D., Mulder, P., El Amranii, M., Beseme, O., ... & Pinet, F. (2016). Increased level of phosphorylated desmin and its degradation products in heart failure. Biochemistry and biophysics reports, 6, 54-62. 全文 【预制胶浓度10%】 |
| 4. | Boisvert, R. A., Schuttert, C. W., Shanahan, L. M., & Howlett, N. G. (2015). Characterization of a Putative Cyclin Dependent Kinase Phosphorylation Site Cluster in FANCD2. Further Insights Into the Regulation of the Fanconi Anemia FANCD2 Protein, 106-168. 全文 【预制胶浓度6%】 |
| 5. | Chen, A. H., Lubkowicz, D., Yeong, V., Chang, R. L., & Silver, P. A. (2015). Transplantability of a circadian clock to a noncircadian organism. Science advances, 1(5), e1500358. 全文 【IF：13.116】 |
| 6. | Chung, S., Kijima, K., Kudo, A., Fujisawa, Y., Harada, Y., Taira, A., ... & Nakamura, Y. (2016). Preclinical evaluation of biomarkers associated with antitumor activity of MELK inhibitor. Oncotarget, 7(14), 18171. 全文 【IF：5.168（2016年），预制胶浓度12.5%】 |
| 7. | Ciftci, H. I., Fujino, H., Koga, R., Yamamoto, M., Kawamura, S., Tateishi, H., ... & Fujita, M. (2015). Mutational analysis of HIV-2 Vpx shows that proline residue 109 in the poly-proline motif regulates degradation of SAMHD1. FEBS letters, 589(13), 1505-1514. 全文 【IF：3.057，预制胶浓度15%】 |
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| 23. | Tavernier, Q., Bennana, E., Poindessous, V., Schaeffer, C., Rampoldi, L., Pietrancosta, N., & Pallet, N. (2018). Regulation of IRE1 RNase activity by the Ribonuclease inhibitor 1 (RNH1). Cell Cycle, 17(15), 1901-1916. 全文 【IF：3.699】 |
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| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 备注 |
| 193-16711 | SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%, 13 well Phos-tag 13孔10%预制胶 |
5块 | - | - |
| 190-16721 | SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%, 17 well Phos-tag 17孔10%预制胶 |
5块 | - | - |
| 195-16391 | SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 12.5%, 13 well Phos-tag 13孔12.5%预制胶 |
5块 | - | - |
| 193-16571 | SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 12.5%, 17 well Phos-tag 17孔12.5%预制胶 |
5块 | - | - |
| 193-16691 | SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%, 13 well Phos-tag 13孔15%预制胶 |
5块 | - | - |
| 196-16701 | SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%, 17 well Phos-tag 17孔15%预制胶 |
5块 | - | - |
| 197-16851 | SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 17.5%, 13 well Phos-tag 13孔17.5%预制胶 |
5块 | - | - |
| 194-16861 | SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 17.5%, 17 well Phos-tag 17孔17.5%预制胶 |
5块 | - | - |
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