利用 Wakopak® Ultra APDSTAG® 定量
检测氨基酸饮料的氨基酸
和光纯药工业株式会社 试剂化学实验室 須藤 勇紀
◆前言
自从天冬酰胺在1806年从芦笋汁中分离成功以来，人们开始发现氨基酸，并将其大致分为四类，即作为营养物质的利用，作为味道成分的利用，生理作用的利用，反应性的利用，这些功能在我们生活中是不可缺少的 1）。另外，在动物体内无法合成的氨基酸既是动物的必需氨基酸，也是很重要的食物营养素。
在日本实施的1991年特定保健食品体系、2002年保健功能食品体系、2015年功能性食品体系过程中，也是期待着将氨基酸作为保健品用于国民自我治疗药物的实践中 2,3）。功能性标示食品制度因其呈报制度更便于新企业参与。2017年3月特定保健用食品的数量为 1,127 件，功能性标示食品从以往的 815 件正在急剧增加中。从而可预计保健食品市场将迅速扩大。氨基酸作为营养素的功能已被广泛认可，以饮料、健康饮料、果冻等多种形态的氨基酸的食品流通于市场中 1），未来也将继续推出更多含有氨基酸的新型食品。
◆3-氨基吡啶-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（APDS）衍生化
高效液相色谱法（HPLC）中的氨基酸分析衍生化技术是很久以前便存在的，因此市面上也存在许多种类的衍生剂，其中包括茚三酮和邻苯二甲醛。本次介绍的 APDS 氨基酸衍生化技术是一种具有高疏水性，且因其高电离效率更有利于反相 LC/MS（/MS）的方法。
该方法不仅用于味之素株式会社的“Amino index® 癌症风险筛选”（AICS）7）。在食品分析中也用于氨基酸分析专用装备（UF-Amino Station）的分析案例 8）。
Wakopak® Ultra APDSTAG® 是一种专用分析柱，可利用 LC / MS / MS 仪器对 APDS-氨基酸衍生物进行分离分析。本次我们介绍的是使用该柱分析市售氨基酸饮料中的氨基酸种类。
◆实验方法和结果分析
样品前处理和衍生化的流程如图1所示，LC / MS / MS条件如表１所示。 定量采用内标法进行。在这次实验的饮料中，据材料记载氨基酸种类含有甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）和精氨酸（Arg）这六种种类，但市售饮料中都不含表１的 No.13~20 的氨基酸类。图2显示的是市售饮料中的６种氨基酸的 MRM 色谱分析图。接下来，将氨基酸标准品加入到获得该色谱的样品中，并进行回收实验。图３显示的是添加标准品后饮料的 MRM 色谱图，而图４则是加标回收实验的结果显示图。回收率高达 99-103％。
根据这次研究的结果显示，使用 Wakopak® Ultra APDS TAG® 进行 APDS 衍生化的氨基酸定量检测是有效的。虽然这次推出的结果仅限于饮料，但对于分析其他食品和培养液等样品也是有用的，欢迎采购此产品用于定量分析氨基酸。
表１．LC/MS/MS 条件
设备 | Prominence LC-20A XR（岛津公司） |
柱 | Wakopak® Ultra APDS TAG® φ2.1×100 mm（W） |
防护过滤器 | SunShell RP 防护过滤器（Cromanic Technologies） |
流动相 A | APDS TAG® 洗脱液 |
流动相 B | 60％乙腈 |
梯度条件 | 0 min.（A：B=94：6）→0.05 min.（92：8） →1.70 min.（92：8） →1.71 min.（88：12）→4.95 min.（70：30）→5.95 min.（40：60）→5.96 min.（5：95）→6.70 min.（5：95） →6.71 min.（94：6）→12 min.（94：6） |
流量 | 0.3 mL/min. |
柱温 | 40 ℃ |
注射量 | 1 μL |
设备 | LCMS-8030 Plus（岛津公司） |
电离 | ESI positive |
测量模式 | MRM |
DL 温度 | 250 ℃ |
雾化器气体流量 | 1.5 L/min. |
加热块温度 | 250 ℃ |
干燥气体流量 | 10 L/min. |
No. | 组件名称（简称） | 分子量 | 监测因子（m/z） | |
前体 | 制品 | |||
1 | 甘氨酸（Gly） | 75.1 | 196.1 | 121.0 |
2 | 甘氨酸-13C2，15N（Gly-IS） | 78.1 | 199.1 | 121.1 |
3 | 丙氨酸（Ala） | 89.1 | 210.1 | 121.0 |
4 | 丙氨酸-13C3（Ala-IS） | 92.1 | 213.1 | 121.1 |
5 | 缬氨酸（Val） | 117.2 | 238.1 | 121.0 |
6 | 缬氨酸-13C5, 15N（Val-IS） | 123.1 | 244.1 | 121.1 |
7 | 亮氨酸（Leu） | 131.2 | 252.1 | 121.0 |
8 | 异亮氨酸（Ile） | 131.2 | 252.1 | 121.0 |
9 | 亮氨酸-5,5,5-d3（Leu-IS） | 134.2 | 255.1 | 121.1 |
10 | 异亮氨酸-13C6,15N（Ile-IS） | 138.1 | 259.1 | 121.1 |
11 | 精氨酸（精氨酸） | 174.2 | 295.1 | 175.1 |
12 | 精氨酸-15N4（Arg-IS） | 178.2 | 299.1 | 179.1 |
13 | 肌氨酸（Sar） | 89.1 | 210.0 | 121.0 |
14 | 羟脯氨酸（Hypro） | 131.1 | 252.1 | 121.0 |
15 | 天冬酰胺（Asn） | 132.1 | 253.1 | 121.0 |
16 | 天冬氨酸（Asp） | 133.1 | 254.1 | 121.0 |
17 | 谷氨酰胺（Gln） | 146.1 | 267.1 | 121.0 |
18 | 谷氨酸（Glu） | 147.1 | 268.1 | 121.0 |
19 | α-氨基己二酸（α-AAA） | 161.2 | 282.1 | 121.0 |
20 | 瓜氨酸（Cit） | 175.2 | 296.3 | 121.0 |
图2. 市售饮料中６种氨基酸成分的 MRM 色谱图
图3. 添加标准品后饮料的 MRM 色谱图
图4. 加标回收实验的结果显示图
<致谢>感谢味之素股份有限公司的每一位同仁对本产品的合作。
Wako Pack® Ultra APDS Tag® 通用 LC / MS 可以实现高灵敏度和高速氨基酸分析。
◆产品列表
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
235-63973 | Wakopak® Ultra APDS TAG® φ2.1mm × 100mm（ W） | 1支 |
◆相关产品
产品编号 | 产品名称 | 标准/制造商 | 规格 |
Amino Acid Analysis Reagent (for LC/MS) (AminoTag(R)) 氨基酸分析试剂 （用于LC/MS） | 用于氨基酸自动分析 | 100 mg | |
016-28161 | Amino Acids Mixture Standard Solution, Type AN (High Range) 氨基酸混合标准溶液, AN型（高浓度） | 用于氨基酸自动分析 | 1 mL×5A，5 mL |
010-28164 | |||
012-28141 | Amino Acids Mixture Standard Solution, Type B (High Range) 氨基酸混合标准溶液, B型（高浓度） | 用于氨基酸自动分析 | 1 mL×5A，5 mL |
016-28144 | |||
019-28151 | Amino Acids Mixture Standard Solution, Type H (High Range) 氨基酸混合标准溶液, H型（高浓度） | 用于氨基酸自动分析 | 1 mL×5A，5 mL |
013-28154 | |||
APDS TAG® Wako Amino Acids Internal Standard Mixture Solution | 用于氨基酸自动分析 | 1套 | |
APDS Tag Wako Eluent APDS标签洗提液 | 用于氨基酸自动分析 | 1 L | |
APDS Tag Wako Borate Buffer APDS标签硼酸盐缓冲液 | 用于氨基酸自动分析 | 1 L |
参考文献
[1] 味の素株式会社 編：「アミノ酸ハンドブック」 （工業調査会）（2003）.
[2] 大澤 俊彦：化学と生物，44 （6），406 （2006）.
[3] 和田 他：分析化学，65 （6），301 （2016）.
[4] 湯田 直樹：健康・栄養食品研究，16 （1），1 （2017）.
[5] 特許第 4453363 号．
[6] 宮野 博：和光純薬時報，79 （1），2 （2011）.
[7] 今泉 明：化学と生物，53 （3），192 （2015）.
[8] 渡邊 他：島津評論，69 （1・2），47 （2012）.
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