Phos-tag™ 样品预处理攻略


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Phos-tag™ SDS-PAGE容易受样品中EDTA、无机盐、表面活性剂等的影响,造成条带弯曲、变形。因此上样前样品需要进行预处理。


没进行预处理的示例


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图1        

                                图2



◆材料准备


- 待处理蛋白样品*

- 1% DOC(脱氧胆酸钠)

- TCA(三氯乙酸),保存在4℃

- 预冷丙酮

*样品中含有的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、蔗糖等可能会引起沉淀



◆预处理图解


STEP1: 在每200 μL的蛋白样品中加入5 μL 1% DOC


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STEP2: 涡旋混匀并在37℃下孵育10分钟


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STEP3: 加入200 μL 20% TCA


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STEP4: 涡旋混匀并置于冰上5分钟


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STEP5: 4℃ 15000 rpm 离心10分钟


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STEP6: 去上清


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STEP7: 加入500 μL预冷丙酮


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STEP8: 简单混匀


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●  重复步骤5-8


Step 5:4℃ 15000 rpm离心10分钟

Step 6:去上清(丙酮)

Step 7:加入500μL预冷丙酮

Step 8:简单混匀

Step 9:4℃ 15000 rpm离心10分钟

STEP10:吸出丙酮,小心避开沉淀

STEP11:干燥10分钟



STEP12:加入SDS-PAGE样品缓冲液


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STEP13:简单混匀


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注意

· 若沉淀不能完全溶于缓冲液,加入1M Tris·Cl以提高pH



STEP14:超声处理


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STEP15:100℃ 加热5-10分钟


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预处理完整视频请点击此处查看



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