使用细胞融合试剂 GenomONE™-CF进行核移植的方法

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本文介绍的实验方法,是利用灭活仙台病毒(HVJ Envelope:HVJ-E)将供体细胞与小鼠去核未受精卵融合,并进行核移植的方法。



◆实验操作流程


【实验前准备】


HVJ-E悬浮液的制备

将0.26 mL的HVJ Suspending Buffer添加至Freeze-dried HVJ-E 中,使用移液器进行悬浮。

将HVJ-E悬浮液分注为5 μL/tube并存放于-80°C下。冷冻的HVJ-E仅能融解一次。


细胞融合缓冲液(Cell Fusion Buffer)的制备

根据HVJ-E的用量,使用无菌纯水将细胞融合缓冲液(×20)稀释20倍。将稀释后的缓冲液冷藏储存。



【核移植流程(将卵丘细胞用作供体细胞时)】


Step 1:将存放在-80°C下的HVJ-E悬浮液在冰中融解(冻结储存至使用前)

Step 2:使用制备好的细胞融合缓冲液,根据供体细胞的类型, 对HVJ-E悬浮液进行稀释(使用时制备,稀释率见下文)

Step 3:如图1放置供体细胞、HVJ-E、受体去核未受精卵各一滴(室温)


在熟悉核移植操作前,一滴操作所加入的受体去核未受精卵数量少至5~10 μL,可以更有效地进行实验。


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图1:操作方法的示意图


Step 4:使用微吸管从A液滴中吸出1个供体细胞

Step 5:从B液滴中吸出大约体积为供体细胞2~3倍的HVJ-E

Step 6:将供体细胞与HVJ-E以按压方式移植至 C液滴的去核未受精卵中(图 2)

Step 7:在37℃,5% CO2的培养箱中,培养15~30 min(图3)

Step 8:确认融合情况(图4)

Step 9:移至活性化刺激用培养基(不含Ca2+、Mg2 +,含锶和细胞松弛素B的KSOM培养基)中,培养5~6 h。

Step 9:确认原核形成后,移至KSOM培养基并培养到所需的发育阶段。


Step 6 

Step 7

Step 8

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图2:将供体细胞移植至去核胚胎中

图3:移植后

(供体细胞吸附在去核胚胎的上端)

图4:移植15-30 min后

(HVJ-E诱导供体细胞与去核胚胎的融合完成)


图片来源:东海大学医学部基础医学系分子生命科学 本杉奈美老师、木村穣老师


注:对于胚胎干细胞(ES细胞)的核移植情况:与卵丘细胞相同,进行Step 1~ Step 9的操作。

注意对于使用卵母细胞核和受精卵原核进行核置换的情况:在Step 9中移至KSOM培养基并培养到所需的发育阶段。



【结果】


小鼠核移植实验中HVJ-E的稀释率及其融合效率


供体细胞核类型

HVJ-E的稀释率

融合效率※※

卵丘细胞核

5倍

70~80%

胚胎干细胞核(ES细胞)

80~90%

卵母细胞核

10倍

90~100%

受精卵前核

100%


※ HVJ-E悬浮液和缓冲液的稀释液均在使用时制备

※※ n≧200~300

数据来源:东海大学医学部基础医学系分子生命科学 本杉奈美老师、木村穣老师



◆什么是HVJ Envelope(HVJ-E)/ 灭活的仙台病毒?


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HVJ Envelope(HVJ-E)是把仙台病毒(HVJ:Hemagglutinating virus of Japan)的基因组RNA完全灭活并纯化后,仅保留外膜蛋白(HN和F)膜融合活性的粒子。对人或实验动物已经失去了传染性或增殖性,因此无需任何特殊的操作或设备,即可在常规安全等级的实验室中使用。

Kaneda, Y., et al.: Hemagglutinating virus of Japan (HVJ) envelope vector as a versatile gene delivery system. Molecular Therapy, 6, 219-226 (2002)



GenomONE ™-CF 产品规格


产品编号

包装

Freeze-dried HVJ-E

(相当于0.26 mL/支)

HVJ-E Suspending Buffer

(0.5 mL/支)

Cell Fusion Buffer

10mL/支)

388-18721

1 set/pack

1

1

1

384-18723

4 sets/pack

4

3

4


※ 本页面产品仅供研究用,研究以外不可使用。


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